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    細胞培養常見問題及其解決

    發布時間:2021-04-09 17:38:29

    1.?如何選用特殊細胞系培養基?

    培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長??傊?,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。

    2.?何時須更換培養基?

    視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。

    3.?可否使用與原先培養條件不同之培養基?

    不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。

    4?可否使用與原先培養條件不同之血清種類?

    不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

    5?何謂FBS, FCS, CS, HS ?

    FBS (fetal bovine serum)?和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

    6?培養細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?

    一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統,而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養細胞。

    7.Hank's?平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?

    HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。

    8.?細胞之接種密度為何?

    依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

    9.?懸浮性細胞應如何繼代處理?

    一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。

    10.冷凍管應如何解凍?

    取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。

    11.?細胞冷凍管解凍培養時, 是否應馬上去除DMSO?

    除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

    12.?附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

    一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會。

    13.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?

    欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。

    14.?細胞冷凍培養基之成份為何?

    動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。

    15.DMSO?之等級和無菌過濾之方式為何?

    冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

    16.冷凍保存細胞之方法?

    冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

    冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

    17.?細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

    冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

    18.培養基中是否須添加抗生素?

    除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。

    19.應如何避免細胞污染?

    細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。

    20.如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?

    原則上:直接滅菌后丟棄之。

    當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。
    高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。

    1.在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。

    2.分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

    3.每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。

    4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2~3代。

    5.在無抗生素的培養基中培養細胞一代。

    6.重復步驟4。

    7.在無抗生素的培養基中培養4~6代,確定污染是否以已被消除。

    21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞,是否能以肉眼觀察出異狀?

    不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨之。

    22.支原體污染會對細胞培養有何影響?

    支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數, 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。

    23.?偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?

    直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。

    24. CO2?培養箱之水盤如何保持清潔?

    定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

    25.為何培養基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會偏暗紅色, 且pH值會越來越偏堿性?

    培養基保存于4 °C 冰箱中, 培養基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時,可以通入無菌過濾之CO2, 以調整pH 值。

    26.?各種細胞培養用的dish,flask是否均相同?

    不同廠牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對大部分細胞沒有太大之影響,惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

    27.?購買之細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少之情形?

    研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少, 大都是因為離心過程操作上的失誤,造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心, 應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

    28.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?

    研究人員在細胞培養時出現存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。

    29.?收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?

    冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

    30.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?

    L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

    31.GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?

    GlutaMAX-I?二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。
    GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

    32.什么培養基中可以省去加酚紅?

    酚紅在培養基中用作PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。

    33.如何用臺盼蘭計數活細胞?

    用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200~2000個/毫升,在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞?;罴毎懦馀_盼蘭,因而染成藍色細胞是死細胞。

    34.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?

    丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

    35.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?

    二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。

    36.室溫下配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時PH值是多少?

    緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時,不同PH值。

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    37.如何從T25瓶中轉移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎?

    我們推薦使用脫落細胞的方法,此技術破壞性最小,生活力最高。通過使用巴斯德吸液管,讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。

    38.胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞:

    1.?去除培養基。

    2.?用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS。

    3.?加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。

    4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。

    5.?向細胞中加入2ml 細胞培養液,移入錐形管,用2ml培養液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養基中的FBS終止了胰酶的活性。)

    6.?離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。

    7.?用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。

    39.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時,肝素的使用量是多少?

    為了防止懸浮培養細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

    40.在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數的增加,它的感染能力會降低嗎?

    通常情況當細胞經過30次傳代后,應該返回凍存。無論什么時候計數時,都應該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。

    41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基,在放置幾天后顏色變紫?

    這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時,碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口,在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘,來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。

    42.?細胞培養基偶然被凍,可否繼續使用?

    如果細胞培養基偶然被凍,您應該熔化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生,培養基可以正常使用,如果出現沉淀,只能丟棄這些培養基。

    43.?無血清培養與有血清培養使用的抗生素量一樣嗎?

    當在無血清培養基中添加抗生素時,降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下,抗生素不被滅活,可能對于細胞達到毒性水平。

    44.?培養基中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎?

    一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

    45.培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎?

    大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。

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